賽默飛分光光度計NanoDrop Eight核酸檢測

一、引言

核酸濃度和純度的準(zhǔn)確測定，是分子生物學(xué)實驗中不可或缺的環(huán)節(jié)。無論是質(zhì)粒構(gòu)建、PCR擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄組建庫還是高通量測序，樣品核酸質(zhì)量直接決定下游實驗成敗。賽默飛NanoDrop Eight作為多通道超微量分光光度計，憑借其快速、便捷、節(jié)省樣品的優(yōu)勢，成為全球?qū)嶒炇疫M(jìn)行核酸定量檢測的主流工具。它能夠在1–2 μL樣品體積下完成DNA、RNA的濃度和純度分析，并以八通道并行檢測實現(xiàn)高通量處理，極大提高實驗效率。

二、核酸檢測的原理基礎(chǔ)

1. 紫外吸收特性

核酸分子在260 nm波長處有最大吸收峰，這是由于堿基中的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)對紫外光的強(qiáng)烈吸收。因此，NanoDrop Eight通過測定260 nm處的吸光度來計算核酸濃度。

2. 朗伯–比爾定律

檢測遵循公式：

$$A=\epsilon ?c?l$$

其中，A為吸光度，ε為消光系數(shù)（DNA取50 μg/mL時A260=1），c為濃度，l為光程。NanoDrop采用固定光程設(shè)計，保證檢測結(jié)果穩(wěn)定。

3. 純度指標(biāo)

• 260/280比值：反映蛋白質(zhì)污染情況。純DNA一般在1.8左右，RNA約為2.0。

• 260/230比值：用于判斷有機(jī)物、鹽類殘留。理想范圍為2.0–2.2。

三、NanoDrop Eight核酸檢測的功能與優(yōu)勢

1. 微量樣品需求

僅需1–2 μL即可完成檢測，大大節(jié)省了實驗材料，特別適合珍貴或低產(chǎn)量樣品。

2. 八通道設(shè)計

可同時檢測八個樣品，顯著縮短檢測時間，適合高通量實驗。

3. 自動光程調(diào)節(jié)

根據(jù)樣品濃度自動調(diào)整光程（0.05–1 mm），確保從稀釋樣品到高濃度樣品均能準(zhǔn)確測定。

4. 寬波長范圍

支持190–850 nm的全光譜掃描，能夠?qū)怂峒兌冗M(jìn)行全面評估。

5. 數(shù)據(jù)管理與導(dǎo)出

檢測結(jié)果自動生成濃度、比值和光譜曲線，可一鍵導(dǎo)出至Excel或?qū)嶒炇倚畔⑾到y(tǒng)，便于記錄與追溯。

四、核酸檢測的標(biāo)準(zhǔn)操作流程

1. 樣品準(zhǔn)備

• 核酸應(yīng)溶解于純水或低鹽緩沖液，避免殘留蛋白、酚或鹽類。

• 檢測前輕輕混勻，避免沉淀導(dǎo)致吸光度不均。

2. 空白設(shè)置

以溶解核酸的緩沖液作為空白對照，確保背景吸收被正確扣除。

3. 加樣檢測

• 將1–2 μL核酸溶液滴加至檢測平臺。

• 關(guān)閉上臂，系統(tǒng)自動完成檢測。

• 八通道樣品可一次性完成。

4. 數(shù)據(jù)讀取

• 濃度值以ng/μL顯示。

• 自動生成260/280和260/230比值，判斷樣品純度。

5. 平臺清潔

每次檢測后用去離子水或無核酸酶水擦拭平臺，防止交叉污染。

五、結(jié)果解讀與實驗心得

1. 濃度結(jié)果

DNA樣品濃度范圍覆蓋2–15,000 ng/μL，RNA檢測靈敏度同樣較高。實驗中發(fā)現(xiàn)，NanoDrop Eight對高濃度核酸自動縮短光程，避免吸收飽和，從而保證精度。

2. 純度比值

• 260/280 <1.7：提示蛋白殘留。

• 260/230 <1.8：提示鹽類或有機(jī)物污染。

• 比值過高：可能有RNA殘留或緩沖液成分影響。
  心得是，單純依賴比值判斷不足，結(jié)合電泳結(jié)果更為可靠。

3. 光譜曲線

全波長掃描可直觀看到吸收峰形態(tài)。例如，酚污染時在230 nm處出現(xiàn)明顯峰值。經(jīng)驗表明，曲線分析能幫助快速定位污染來源。

4. 重復(fù)性與精度

多次測定同一樣品，NanoDrop Eight的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）通常低于2%，說明其精度足以滿足大多數(shù)分子實驗要求。

六、質(zhì)量控制與檢測精度保障

1. 定期校準(zhǔn)

使用標(biāo)準(zhǔn)濾光片校準(zhǔn)波長，保證檢測位置準(zhǔn)確。

2. 儀器自檢

NanoDrop Eight開機(jī)自檢可自動監(jiān)控光源和光學(xué)系統(tǒng)，確保每次檢測的可靠性。

3. 空白對照

每次實驗必須重新設(shè)置空白，避免因緩沖液差異引入系統(tǒng)誤差。

4. 樣品處理

• 去除蛋白、鹽和酚殘留可顯著提高檢測精度。

• 建議在關(guān)鍵實驗中結(jié)合Qubit熒光法進(jìn)行交叉驗證。

七、典型應(yīng)用場景

1. 分子克隆實驗

在質(zhì)粒提取后快速檢測濃度與純度，確定是否適合下游轉(zhuǎn)染或PCR。

2. 高通量測序建庫

RNA提取后檢測濃度和純度，評估是否符合建庫要求。NanoDrop Eight的八通道功能可快速篩選大量樣品。

3. 臨床分子診斷

對臨床樣本中的DNA/RNA進(jìn)行定量，為基因檢測提供可靠起點(diǎn)。

4. 教學(xué)實驗

其操作簡便、結(jié)果直觀，適合學(xué)生理解核酸吸收特性和檢測原理。

八、優(yōu)勢與不足

1. 優(yōu)勢

• 樣品量小，節(jié)省資源。

• 檢測快速，適合高通量實驗。

• 操作簡便，結(jié)果直觀。

• 精度高，重復(fù)性好。

2. 不足

• 對低濃度樣品敏感度有限，檢測下限高于熒光法。

• 對污染物敏感，易導(dǎo)致純度比值偏差。

• 對極少量RNA樣品，需結(jié)合其他方法驗證。

九、未來發(fā)展方向

1. 更高靈敏度：改進(jìn)光學(xué)設(shè)計，拓展至超低濃度核酸檢測。

2. 智能算法：引入AI分析，自動識別污染模式并提示改進(jìn)。

3. 云端互聯(lián)：將檢測數(shù)據(jù)實時上傳云平臺，便于跨實驗室共享與質(zhì)控。

4. 多模態(tài)檢測：未來有望融合熒光檢測與光譜分析，提升準(zhǔn)確性。

十、結(jié)語

NanoDrop Eight在核酸檢測中展現(xiàn)出微量、快速、高通量和高精度的顯著優(yōu)勢。其八通道設(shè)計不僅提升了效率，也減少了人為操作帶來的誤差。雖然在低濃度和雜質(zhì)干擾方面存在一定局限，但通過合理的樣品處理、空白設(shè)置與交叉驗證，可以有效保證檢測結(jié)果的可靠性。總體而言，NanoDrop Eight已成為現(xiàn)代分子實驗室進(jìn)行核酸檢測的核心工具，為科研、臨床和教學(xué)提供了堅實保障。