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伯樂（Bio-Rad）電穿孔儀165-2660是一款專為生命科學(xué)研究設(shè)計(jì)的高性能電轉(zhuǎn)化設(shè)備，廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體及真核體系的基因?qū)雽?shí)驗(yàn)。
其核心原理是利用瞬時(shí)高壓脈沖在細(xì)胞膜上形成可逆性微孔，使外源DNA、RNA或蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
該設(shè)備以高精度電壓控制、穩(wěn)定的放電波形及靈活的參數(shù)設(shè)置而著稱，支持0.2–2.5 kV電壓范圍、25–3300 μF電容范圍及多模式脈沖輸出。
為確保實(shí)驗(yàn)效果的可靠性和安全性，操作人員應(yīng)嚴(yán)格遵守規(guī)范化的操作流程，正確設(shè)置參數(shù)并妥善維護(hù)儀器。
本指南詳細(xì)介紹伯樂165-2660的操作步驟、參數(shù)調(diào)整、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、常見問題及安全注意事項(xiàng)，旨在幫助科研人員高效掌握儀器操作方法并獲得最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
主機(jī)是整個(gè)設(shè)備的控制中心，內(nèi)部集成高壓電源、控制電路和能量釋放系統(tǒng)。主要功能包括電壓設(shè)定、電容調(diào)節(jié)、脈沖輸出、時(shí)間常數(shù)計(jì)算與安全監(jiān)控。
顯示屏：實(shí)時(shí)顯示電壓、電容、時(shí)間常數(shù)、脈沖次數(shù)等信息；
旋鈕與按鍵：用于輸入?yún)?shù)、啟動(dòng)放電及保存設(shè)置；
指示燈：顯示設(shè)備工作狀態(tài)，如“Ready”“Pulse”“Error”。
電極槽用于連接電轉(zhuǎn)杯，安全蓋配有聯(lián)鎖保護(hù)功能，未關(guān)閉蓋時(shí)系統(tǒng)無法輸出高壓，確保操作安全。
電轉(zhuǎn)杯（0.1 cm、0.2 cm、0.4 cm三種間隙）
高壓連接線
樣品支架與冷卻模塊
接地線與防塵罩
溫度：20–25°C；濕度：≤60%；
電源要求：220V ±10%，接地良好；
操作臺(tái)保持干燥清潔，遠(yuǎn)離水源與電磁干擾源。
在每次使用前，檢查以下項(xiàng)目：
電源線連接是否牢固；
電極槽與電轉(zhuǎn)杯是否清潔干燥；
安全蓋感應(yīng)開關(guān)功能是否正常；
屏幕顯示與按鍵響應(yīng)是否正常；
上次實(shí)驗(yàn)后的殘余電荷已完全釋放。
若發(fā)現(xiàn)異常，如屏幕閃爍或“Error”提示，應(yīng)立即停止使用并聯(lián)系技術(shù)人員。
細(xì)胞要求：
細(xì)胞需處于生理活躍期或?qū)?shù)生長(zhǎng)期；
通過離心去除培養(yǎng)基并用低離子緩沖液洗滌3–4次；
樣品懸液導(dǎo)電性低于5 μS/cm，以防放電不穩(wěn)；
樣品濃度控制在1×10? cells/mL左右。
DNA/RNA要求：
純度高，A260/A280比值在1.8–2.0；
無鹽、無乙醇?xì)埩簦?/span>
濃度一般為10–100 ng/μL。
接通電源，設(shè)備自動(dòng)進(jìn)行系統(tǒng)自檢；
確認(rèn)顯示屏出現(xiàn)“Bio-Rad 165-2660 Ready”；
檢查風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)與指示燈狀態(tài)，確保設(shè)備處于待機(jī)模式。
按下 “Parameter” 鍵進(jìn)入設(shè)置菜單，依次設(shè)定以下參數(shù)：
電壓（Voltage）：根據(jù)細(xì)胞類型選擇
細(xì)菌：2.3–2.5 kV
酵母：1.0–1.5 kV
哺乳細(xì)胞：0.25–0.8 kV
植物原生質(zhì)體：0.6–1.0 kV
電容（Capacitance）：
范圍：25–3300 μF
推薦：細(xì)菌25 μF、酵母50 μF、哺乳細(xì)胞250 μF、原生質(zhì)體1000 μF
脈沖次數(shù)（Pulse）：
單脈沖用于細(xì)菌與酵母；
雙脈沖用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染（間隔100 ms）。
時(shí)間常數(shù)顯示（τ）：系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算并在放電后顯示，理想值為4–10 ms。
設(shè)置完成后，按下 “Enter” 鍵確認(rèn)并返回主界面。
將處理好的細(xì)胞與DNA混合液加入電轉(zhuǎn)杯，體積約為80–100 μL；
輕輕敲擊杯壁，確保無氣泡；
將電轉(zhuǎn)杯置于冷卻模塊中預(yù)冷約1分鐘；
插入主機(jī)電極槽，確?？ㄈ攵ㄎ徊?；
關(guān)閉安全蓋，屏幕顯示“Ready”。
按下 “Pulse” 或 “Start” 鍵，設(shè)備發(fā)出短促提示音；
放電瞬間屏幕顯示實(shí)際電壓與時(shí)間常數(shù)；
放電完成后系統(tǒng)自動(dòng)放電，等待數(shù)秒，屏幕恢復(fù)“Ready”。
若出現(xiàn)“ARC DETECTED”提示，說明樣品中存在電弧放電，應(yīng)重新洗滌細(xì)胞或更換緩沖液。
立即使用無菌移液器吸出樣品，加入適宜培養(yǎng)基復(fù)蘇：
細(xì)菌：加入SOC培養(yǎng)基，在37°C搖床復(fù)蘇1小時(shí)；
酵母：在30°C培養(yǎng)30–60分鐘；
哺乳細(xì)胞：轉(zhuǎn)移至含血清培養(yǎng)基中靜置復(fù)蘇2小時(shí)；
植物原生質(zhì)體：放入等滲液中靜置12小時(shí)。
| 細(xì)胞類型 | 電壓（kV） | 電容（μF） | 電轉(zhuǎn)杯間隙（cm） | 時(shí)間常數(shù)（ms） |
|---|---|---|---|---|
| 大腸桿菌 | 2.5 | 25 | 0.2 | 4–5 |
| 酵母 | 1.2 | 50 | 0.2 | 6–8 |
| 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 | 0.45 | 250 | 0.4 | 8–10 |
| 植物原生質(zhì)體 | 0.8 | 1000 | 0.4 | 10–12 |
| 放線菌 | 1.5 | 100 | 0.2 | 5–7 |
可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)適當(dāng)微調(diào)參數(shù)，優(yōu)化結(jié)果。
放電結(jié)束后等待30秒，讓設(shè)備自動(dòng)放電完畢；
用無離子水沖洗電極槽與電轉(zhuǎn)杯；
必要時(shí)使用70%乙醇清洗并自然晾干；
不得使用強(qiáng)酸或金屬刷清潔。
記錄實(shí)驗(yàn)條件與結(jié)果，包括：
電壓、電容、時(shí)間常數(shù)；
樣品類型與濃度；
轉(zhuǎn)化效率與復(fù)蘇情況。
165-2660具備自動(dòng)記錄功能，可存儲(chǔ)最近1000次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
按下 “Power Off” 鍵關(guān)閉設(shè)備；
斷開電源線與接地線；
用干布擦拭儀器外殼；
覆蓋防塵罩存放。
放電前務(wù)必確保安全蓋關(guān)閉，否則系統(tǒng)將拒絕輸出。
禁止在設(shè)備帶電狀態(tài)下插拔電轉(zhuǎn)杯或連接線。
不得使用含鹽或?qū)щ娦愿叩木彌_液，以防電弧放電。
放電后需等待數(shù)秒，確保殘余電荷完全釋放。
避免連續(xù)放電超過10次，應(yīng)間隔30秒以上防止過熱。
操作時(shí)佩戴絕緣手套并保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境干燥。
若設(shè)備發(fā)出異響或有異味，應(yīng)立即斷電檢查。
| 問題 | 可能原因 | 解決辦法 |
|---|---|---|
| 放電失敗 | 安全蓋未關(guān)閉或電極未接觸 | 檢查安全蓋與電轉(zhuǎn)杯位置 |
| 電弧放電 | 樣品中有氣泡或鹽分過高 | 重新洗滌樣品并排氣泡 |
| 時(shí)間常數(shù)過低 | 電阻過小或緩沖液導(dǎo)電性高 | 更換低離子緩沖液 |
| 時(shí)間常數(shù)過高 | 電容過大或樣品體積過小 | 調(diào)整電容或增加樣品體積 |
| 轉(zhuǎn)化效率低 | 電壓不足或細(xì)胞狀態(tài)差 | 提高電壓或使用新鮮樣品 |
| 樣品過熱 | 放電間隔太短 | 延長(zhǎng)間隔或使用冷卻模塊 |
電壓校準(zhǔn)：每6個(gè)月使用校準(zhǔn)適配器檢測(cè)輸出精度，誤差應(yīng)≤±1%。
電容檢測(cè)：每12個(gè)月檢測(cè)一次，偏差超過5%需更換。
電極維護(hù)：定期清潔并檢查是否有腐蝕或變色。
線纜檢查：防止老化、彎折和破損。
軟件升級(jí)：根據(jù)伯樂官方更新版本執(zhí)行升級(jí)。
良好的維護(hù)能確保設(shè)備長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行，并保持實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性。
樣品優(yōu)化
保持低離子環(huán)境，防止電弧；
調(diào)整細(xì)胞密度，使能量分布均勻；
DNA應(yīng)高純無污染。
參數(shù)優(yōu)化
首次實(shí)驗(yàn)建議采用中等電壓與電容；
根據(jù)轉(zhuǎn)化效率逐步微調(diào)；
觀察時(shí)間常數(shù)是否穩(wěn)定在目標(biāo)范圍內(nèi)。
復(fù)蘇條件優(yōu)化
及時(shí)復(fù)蘇，防止膜損傷進(jìn)一步惡化；
對(duì)哺乳細(xì)胞可加入抗氧化劑或復(fù)蘇促進(jìn)因子；
植物原生質(zhì)體需在等滲環(huán)境中恢復(fù)。
數(shù)據(jù)管理
建立實(shí)驗(yàn)參數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)；
分析不同細(xì)胞類型下的電壓、電容與效率關(guān)系；
為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供經(jīng)驗(yàn)參考。
示例一：大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
電壓：2.5 kV
電容：25 μF
電轉(zhuǎn)杯間隙：0.2 cm
時(shí)間常數(shù)：約4.9 ms
結(jié)果：轉(zhuǎn)化效率1×10? CFU/μg DNA
示例二：哺乳細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)染
電壓：0.45 kV
電容：250 μF
脈沖：2次，間隔100 ms
時(shí)間常數(shù)：8.5 ms
結(jié)果：細(xì)胞活性70%，目標(biāo)蛋白高表達(dá)。
通過標(biāo)準(zhǔn)化操作與參數(shù)優(yōu)化，可獲得穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與高重復(fù)性。
杭州實(shí)了個(gè)驗(yàn)生物科技有限公司
