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質(zhì)保3年只換不修，廠家長沙實(shí)了個(gè)驗(yàn)儀器制造有限公司

一、概述

伯樂電穿孔儀 165-2661 是一款針對基因?qū)?、蛋白質(zhì)遞送、RNA 轉(zhuǎn)染與藥物電穿孔等應(yīng)用而設(shè)計(jì)的高精度儀器。
要獲得高轉(zhuǎn)化效率與良好細(xì)胞存活率，必須在操作前充分了解樣品要求。樣品條件直接影響電場分布、電導(dǎo)特性及膜孔形成，因此樣品準(zhǔn)備的規(guī)范化是確保實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。

本指南全面介紹不同類型樣品（細(xì)菌、酵母、動物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體及特殊體系）在電穿孔前的準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)，幫助研究者科學(xué)設(shè)定實(shí)驗(yàn)條件。

二、樣品基本要求

1. 純凈度要求

• 樣品中不得含有任何鹽離子、培養(yǎng)基殘留或高導(dǎo)電雜質(zhì)。

• 若使用含鹽溶液（如 PBS、LB、DMEM 等），會在放電瞬間產(chǎn)生電弧，導(dǎo)致樣品炭化或細(xì)胞死亡。

• 推薦使用低離子緩沖液或無離子水系統(tǒng)溶液，如 1 mM HEPES 或 無離子 Tris。

2. 電導(dǎo)率要求

理想電導(dǎo)率：0.5–1.5 mS/cm。

• 電導(dǎo)率過高 → 電弧風(fēng)險(xiǎn)增加、時(shí)間常數(shù)下降；

• 電導(dǎo)率過低 → 電場分布不均，能量釋放不充分。

可使用電導(dǎo)儀檢測樣品電導(dǎo)率并調(diào)整緩沖液比例。

3. 懸液均勻性

樣品必須為單細(xì)胞懸液。聚集或沉降會造成局部電場過強(qiáng)。

• 建議使用輕柔吹打或短時(shí)間低速離心重懸；

• 不可劇烈震蕩，以免造成細(xì)胞膜破裂。

4. 溫度要求

所有樣品在放電前需預(yù)冷至 4℃。
低溫可：

• 降低熱積累；

• 提高細(xì)胞膜修復(fù)能力；

• 穩(wěn)定電阻與時(shí)間常數(shù)。

放電后立即轉(zhuǎn)入預(yù)溫 37℃ 培養(yǎng)基恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)。

5. 體積與濃度

電擊杯中加入樣品體積不超過總?cè)莘e 80%。

• 0.1 cm 杯：40–50 μL；

• 0.2 cm 杯：60–80 μL；

• 0.4 cm 杯：400–800 μL。

細(xì)胞濃度建議：

三、細(xì)胞樣品制備要求

（一）細(xì)菌

1. 生理狀態(tài)
應(yīng)選取對數(shù)生長期細(xì)胞（ OD??? ≈ 0.5–0.7 ），此時(shí)期膜結(jié)構(gòu)最具可逆性。

2. 洗滌步驟

• 取培養(yǎng)液 10 mL， 4℃ 離心 4000 rpm × 5 min；

• 棄上清，用 無離子 水或 10% 甘油洗滌 3 次；

• 最終重懸于 1 mM HEPES 或 10% 甘油中。

3. DNA 加入量
推薦 1–10 ng 高純度質(zhì)粒；過量 DNA 可能影響電場均勻。

4. 典型電壓區(qū)間
1800–2500 V （0.2 cm 電極間隙）。

（二）酵母

1. 細(xì)胞培養(yǎng)
取對數(shù)期 Saccharomyces cerevisiae 培養(yǎng)物（ OD??? ≈ 1.0 ）。

2. 預(yù)處理

• 洗滌 3 次 → 去除培養(yǎng)基鹽分；

• 重懸于 1 M 山梨醇 緩沖液（維持滲透壓）；

• 冰上靜置 10 min。

3. DNA 添加量
100–500 ng 高純度質(zhì)粒 DNA。

4. 推薦條件
電壓 1400–1600 V，電場 6–8 kV/cm，時(shí)間常數(shù) 6–8 ms。

（三）哺乳動物細(xì)胞

1. 細(xì)胞狀態(tài)
細(xì)胞應(yīng)處于 80% 融合或懸浮生長對數(shù)期，避免凋亡或高密度狀態(tài)。

2. 培養(yǎng)條件

• 使用無血清培養(yǎng)液或 Opti-MEM 稀釋；

• 不可含 NaCl > 20 mM；

• 細(xì)胞經(jīng) PBS 兩次洗滌后重懸于低導(dǎo)緩沖液。

3. DNA/RNA 或蛋白質(zhì)添加
每 0.4 mL 樣品加入 1–2 μg 質(zhì)?；?mRNA。

4. 推薦電壓
400–700 V （0.4 cm 間距，方波模式），時(shí)間常數(shù) 6–8 ms。

5. 復(fù)蘇要求
電擊后立即轉(zhuǎn)入 37℃ 含血清培養(yǎng)基恢復(fù) 1–2 小時(shí)。

（四）植物原生質(zhì)體

1. 原生質(zhì)體提取
從新鮮葉片中經(jīng)酶解獲得單細(xì)胞懸液。

2. 洗滌
用 0.4 M 甘露醇溶液洗滌 2 次以維持滲透平衡。

3. DNA 用量
5–10 μg 純化質(zhì)粒 DNA。

4. 推薦條件
電壓 600–800 V，電場 1.5–2 kV/cm，方波模式，時(shí)間常數(shù) 8–9 ms。

5. 特別注意
原生質(zhì)體對剪切力極敏感，操作需輕柔，禁止震蕩。

（五）特殊樣品體系

1. 藻類與真菌孢子

• 電場強(qiáng)度 4–7 kV/cm；

• 需預(yù)冷 + 甘油保護(hù)；

• DNA 濃度 50–200 ng/樣。

2. 納米顆粒與藥物遞送體系

• 溶劑必須無離子且 pH 7.0 ± 0.2；

• 顆粒均勻分散，避免團(tuán)聚；

• 體積 ≤ 0.5 mL。

3. 臨床細(xì)胞樣品

如 T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞等免疫體系：

• 使用專用電穿孔緩沖液（低鈉、無血清）；

• 電壓 200–400 V，多脈沖模式。

四、緩沖液與化學(xué)環(huán)境要求

1. 推薦緩沖體系

2. pH 要求

維持在 6.8–7.4 之間。酸堿偏差會影響膜穩(wěn)定性和離子遷移。

3. 溫度與儲存

所有緩沖液需 4℃ 保存，不得使用陳舊或受污染溶液。使用前恢復(fù)至室溫以避免電導(dǎo)率突變。

五、外源分子要求

1. 質(zhì)粒 DNA

• 純度 ≥ 1.8 (A???/A???)；

• 無蛋白、無鹽；

• 線性化或超螺旋形式均可。

2. RNA 或 mRNA

• 純度 ≥ 2.0；

• 使用 DEPC 水溶解；

• 防止反復(fù)凍融。

3. 蛋白質(zhì)

• 緩沖液離子強(qiáng)度低；

• 濃度 < 1 mg/mL；

• 避免含 Tris-HCl > 20 mM 或鹽。

4. 納米顆?；蛩幬?/span>

• 分散體系透明無沉淀；

• 顆粒直徑 < 200 nm；

• 溶劑需無機(jī)鹽 < 1 mM。

六、樣品準(zhǔn)備常見問題與排除

七、樣品存放與運(yùn)輸

1. 短期保存：冰上保存 ≤ 1 小時(shí)；

2. 長期保存：離心后棄上清，細(xì)胞重懸于 10% 甘油，–80℃ 凍存；

3. 運(yùn)輸要求：使用干冰運(yùn)輸，避免溫度波動。

DNA、RNA 等外源分子需獨(dú)立低溫保存，防止降解。

八、樣品檢測與預(yù)評估

在電穿孔前應(yīng)進(jìn)行以下檢測：

1. 細(xì)胞活性檢測：用 Trypan Blue 染色，活性 > 95% 方可使用。

2. 電導(dǎo)率檢測：用便攜式電導(dǎo)儀，確保在 0.5–1.5 mS/cm 之間。

3. 體積確認(rèn)：注入電擊杯前檢查氣泡并控制在安全容積。

4. 樣品均勻性：顯微鏡下應(yīng)無明顯團(tuán)塊。

九、不同體系推薦樣品標(biāo)準(zhǔn)

十、安全與規(guī)范

• 所有樣品均應(yīng)在 BSL-2 或等同條件下操作；

• 處理人體細(xì)胞或臨床樣品時(shí)需使用獨(dú)立電擊杯；

• 放電前確認(rèn)蓋鎖閉合并佩戴絕緣手套；

• 實(shí)驗(yàn)臺保持干燥、防止液體外溢；

• 廢棄樣品經(jīng)高壓滅菌后棄置。

十一、實(shí)驗(yàn)前檢查清單

1. 樣品無鹽、無氣泡；

2. 電導(dǎo)率檢測合格；

3. 體積適配電擊杯；

4. 外源分子純度合格；

5. 電極與杯體干燥；

6. ShockPod 蓋鎖正常；

7. 參數(shù)設(shè)定匹配樣品類型。

十二、樣品準(zhǔn)備優(yōu)化建議

1. 減少鹽離子殘留：離心后用低離子緩沖液反復(fù)洗滌；

2. 提高膜穩(wěn)定性：添加 甘油 5–10% 作為保護(hù)劑；

3. 提升導(dǎo)入率：保持對數(shù)期細(xì)胞活性；

4. 避免熱積累：每次放電間隔 ≥ 10 秒；

5. 使用新鮮樣品：避免冷凍反復(fù)融化造成膜損傷。

十三、樣品要求對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

因此，樣品質(zhì)量控制是確保數(shù)據(jù)可重復(fù)性的基礎(chǔ)。