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伯樂（Bio-Rad）電穿孔儀165-2660是一款精密的電轉(zhuǎn)化設(shè)備，用于將外源DNA、RNA或蛋白質(zhì)分子導(dǎo)入細(xì)胞、原生質(zhì)體或組織樣品中。該儀器通過在細(xì)胞膜上施加瞬時(shí)高壓脈沖，產(chǎn)生可逆性納米級(jí)孔洞，使分子能夠透過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
作為國(guó)際實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備之一，165-2660以其高精度電壓控制、寬范圍電容可調(diào)與卓越的時(shí)間常數(shù)穩(wěn)定性著稱。為了確保實(shí)驗(yàn)的高效性與結(jié)果的可重復(fù)性，嚴(yán)格遵循規(guī)范化的操作流程至關(guān)重要。
本操作指南將從設(shè)備準(zhǔn)備、參數(shù)設(shè)定、樣品處理、放電操作、數(shù)據(jù)記錄及安全收尾等環(huán)節(jié)，系統(tǒng)闡述165-2660的標(biāo)準(zhǔn)化操作步驟，幫助研究人員高效、安全地完成電穿孔實(shí)驗(yàn)。
溫度要求：20–25°C
濕度要求：≤60%
電源規(guī)格：220V ±10%，50/60Hz，接地良好
操作臺(tái)要求：干燥、平穩(wěn)、無(wú)金屬裸露與液體濺灑
照明條件：環(huán)境光充足，以便觀察電極與顯示狀態(tài)
實(shí)驗(yàn)環(huán)境應(yīng)避免高濕或強(qiáng)磁干擾，設(shè)備周圍保持至少30 cm的通風(fēng)間距。
在正式實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行全面設(shè)備檢查：
| 檢查項(xiàng)目 | 要求 | 說明 |
|---|---|---|
| 電源線連接 | 穩(wěn)固無(wú)松動(dòng) | 確保接地良好 |
| 顯示屏狀態(tài) | 無(wú)閃爍與異常字符 | 若不亮需檢查保險(xiǎn)絲 |
| 電轉(zhuǎn)杯接口 | 清潔干燥無(wú)鹽分 | 避免電弧放電 |
| 安全蓋 | 感應(yīng)正常 | 未閉合則儀器無(wú)法放電 |
| 按鍵與旋鈕 | 反饋靈敏 | 任何延遲需校修 |
| 內(nèi)部風(fēng)扇 | 運(yùn)行正常 | 防止過熱 |
儀器通電后進(jìn)行自檢，若屏幕顯示“Ready”，則系統(tǒng)正常。
電轉(zhuǎn)杯：標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格0.1 cm、0.2 cm、0.4 cm，根據(jù)實(shí)驗(yàn)選擇；
細(xì)胞樣品：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞；
緩沖液：低離子強(qiáng)度緩沖液（如1 mM HEPES）；
DNA/RNA溶液：純度高、無(wú)鹽殘留；
無(wú)菌移液器與吸頭：防止污染；
冰浴或冷卻模塊：用于放電前冷卻樣品。
樣品應(yīng)預(yù)冷至4°C，以減少電穿孔過程中熱效應(yīng)帶來(lái)的細(xì)胞損傷。
連接電源與接地線。
確認(rèn)接地端牢固，以防靜電或電壓泄漏。
按下電源鍵，設(shè)備自動(dòng)進(jìn)入自檢程序。
觀察顯示屏提示：若顯示“System Ready”，則設(shè)備可操作；若出現(xiàn)“Check System”或“Error”，需重新啟動(dòng)或聯(lián)系技術(shù)維護(hù)。
確保安全蓋處于開啟狀態(tài)，便于安裝電轉(zhuǎn)杯。
按下“Set”或“Parameter”鍵，進(jìn)入設(shè)置模式。使用旋鈕或數(shù)字鍵輸入?yún)?shù)值。
范圍：0.2–2.5 kV
調(diào)節(jié)精度：0.01 kV
建議設(shè)置：
細(xì)菌：2.3–2.5 kV
酵母：1.0–1.5 kV
哺乳細(xì)胞：0.25–0.8 kV
植物原生質(zhì)體：0.6–1.0 kV
電壓過高可能引起電弧，過低則無(wú)法形成足夠電場(chǎng)。
范圍：25–3300 μF
推薦設(shè)置：
細(xì)菌：25 μF
酵母：50 μF
哺乳細(xì)胞：250 μF
植物原生質(zhì)體：1000 μF
電容控制能量?jī)?chǔ)存量，需與樣品類型匹配。
伯樂165-2660采用指數(shù)衰減放電。時(shí)間常數(shù)（τ）表示能量釋放速率，單位為毫秒（ms）。系統(tǒng)會(huì)在放電后自動(dòng)計(jì)算實(shí)際τ值。
理想范圍：4–10 ms。
設(shè)備可保存多組實(shí)驗(yàn)程序，設(shè)置完成后按“Store”鍵保存參數(shù)組合，以便重復(fù)使用。
在無(wú)菌條件下，將DNA或RNA加入預(yù)處理細(xì)胞懸液中：
混合后輕輕吹打均勻，避免氣泡；
總體積約為80–100 μL（適用于0.2 cm電轉(zhuǎn)杯）；
樣品濃度：1×10? cells/mL。
使用前徹底清潔并干燥；
若為一次性杯體，拆封后立即使用；
裝樣時(shí)液面應(yīng)覆蓋電極板。
將裝好樣品的電轉(zhuǎn)杯置于冰上或冷卻模塊中冷卻1分鐘。
冷卻可防止熱積累造成細(xì)胞膜破裂。
打開安全蓋；
將電轉(zhuǎn)杯插入電極槽，確?？ㄈ攵ㄎ徊?；
關(guān)閉安全蓋，系統(tǒng)顯示“Ready for Pulse”。
按下“Pulse”鍵啟動(dòng)放電；
放電瞬間，顯示屏同步顯示實(shí)際電壓與時(shí)間常數(shù)；
放電結(jié)束后自動(dòng)進(jìn)入“Cooling”狀態(tài)，系統(tǒng)釋放殘余電荷；
當(dāng)屏幕恢復(fù)顯示“Ready”，方可取出電轉(zhuǎn)杯。
整個(gè)放電過程持續(xù)時(shí)間極短（通常小于10毫秒），但能量釋放極為集中。
操作期間不得觸摸設(shè)備金屬部位；
確保安全蓋關(guān)閉，否則系統(tǒng)拒絕放電；
放電后等待至少10秒再取樣，避免殘余電荷。
放電后立即用無(wú)菌吸頭將樣品轉(zhuǎn)移至含適當(dāng)培養(yǎng)基的離心管中。
若樣品為細(xì)菌，可加入SOC培養(yǎng)基（37°C復(fù)蘇1小時(shí)）。
若為哺乳細(xì)胞，則轉(zhuǎn)移至含血清培養(yǎng)基中靜置復(fù)蘇2小時(shí)。
| 樣品類型 | 復(fù)蘇培養(yǎng)基 | 時(shí)間 | 溫度 |
|---|---|---|---|
| 大腸桿菌 | SOC | 60分鐘 | 37°C |
| 酵母 | YPD | 45分鐘 | 30°C |
| 哺乳細(xì)胞 | DMEM + 10% FBS | 2小時(shí) | 37°C |
| 植物原生質(zhì)體 | W5溶液 | 12小時(shí) | 25°C |
復(fù)蘇期間應(yīng)避免劇烈震蕩，以利細(xì)胞膜修復(fù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，記錄設(shè)備顯示的時(shí)間常數(shù)（τ）。
標(biāo)準(zhǔn)參考范圍：
細(xì)菌：4–5 ms；
酵母：6–8 ms；
哺乳細(xì)胞：8–10 ms。
時(shí)間常數(shù)偏低說明放電過快或樣品電阻低，偏高則代表能量釋放過慢。
若出現(xiàn)“ARC DETECTED”提示，說明放電過程中發(fā)生電弧放電，可能由以下原因引起：
樣品中有氣泡；
電轉(zhuǎn)杯潮濕；
緩沖液離子濃度過高。
應(yīng)重新制備樣品并清潔電轉(zhuǎn)杯后再試。
165-2660可自動(dòng)存儲(chǔ)最近1000組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，包括：
電壓與電容設(shè)定值；
實(shí)測(cè)時(shí)間常數(shù)；
放電次數(shù)；
電弧狀態(tài)記錄。
數(shù)據(jù)可通過USB接口導(dǎo)出，以供統(tǒng)計(jì)分析。
放電時(shí)嚴(yán)禁開啟安全蓋；
使用絕緣手套操作高壓接口；
禁止在濕手條件下觸摸設(shè)備；
確保接地線連接可靠。
實(shí)驗(yàn)后用無(wú)離子水清洗電極槽；
電轉(zhuǎn)杯可用70%乙醇消毒后自然晾干；
不得使用含氯清潔劑；
外殼用干布擦拭，防止積塵。
每6個(gè)月檢測(cè)電壓與電容輸出精度；
每12個(gè)月進(jìn)行一次全面校準(zhǔn)；
若長(zhǎng)時(shí)間未使用，重新開機(jī)前應(yīng)進(jìn)行預(yù)熱10分鐘。
| 問題 | 可能原因 | 處理方式 |
|---|---|---|
| 無(wú)法放電 | 安全蓋未閉合 | 關(guān)閉蓋后重試 |
| 時(shí)間常數(shù)過短 | 電阻過小或緩沖液導(dǎo)電性高 | 使用低離子溶液 |
| 電弧放電 | 杯體潮濕或有氣泡 | 重新裝樣并排氣泡 |
| 樣品溫度升高 | 電容過大或放電頻繁 | 使用冷卻模塊或延長(zhǎng)間隔 |
| 電壓偏差 | 模塊老化或電極腐蝕 | 校準(zhǔn)電源模塊 |
| 顯示異常 | 控制電路受潮 | 關(guān)機(jī)晾干并檢查內(nèi)部元件 |
關(guān)閉設(shè)備電源，待風(fēng)扇停止后拔下電源線；
清理工作臺(tái)面與樣品殘留；
將儀器覆蓋防塵罩并存放于干燥處；
記錄實(shí)驗(yàn)編號(hào)、參數(shù)與結(jié)果，建立電子檔案；
若出現(xiàn)異常放電或設(shè)備報(bào)警，應(yīng)填寫維護(hù)記錄表并通知管理員。
為了確保實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性與一致性，需定期驗(yàn)證設(shè)備性能：
放電穩(wěn)定性測(cè)試：
連續(xù)10次相同條件放電，計(jì)算時(shí)間常數(shù)的平均值與標(biāo)準(zhǔn)差（SD < 0.2 ms）。
電壓精度驗(yàn)證：
使用外部高壓計(jì)測(cè)量輸出電壓，偏差不得超過±1%。
轉(zhuǎn)化效率驗(yàn)證：
使用標(biāo)準(zhǔn)樣品（如pUC19質(zhì)粒與大腸桿菌DH5α）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)比歷史轉(zhuǎn)化效率，應(yīng)在正常范圍內(nèi)波動(dòng)（±10%）。
安全功能驗(yàn)證：
在安全蓋打開狀態(tài)下測(cè)試放電鎖定功能，確保系統(tǒng)自動(dòng)中斷。
實(shí)驗(yàn)過程中，可根據(jù)樣品反應(yīng)情況微調(diào)參數(shù)以獲得最佳結(jié)果：
| 樣品類型 | 建議電壓（kV） | 電容（μF） | 目標(biāo)時(shí)間常數(shù)（ms） |
|---|---|---|---|
| 大腸桿菌 | 2.5 | 25 | 4.8 |
| 酵母 | 1.2 | 50 | 7.0 |
| 哺乳細(xì)胞 | 0.45 | 250 | 9.0 |
| 植物原生質(zhì)體 | 0.8 | 1000 | 11.0 |
若轉(zhuǎn)化效率偏低，可微調(diào)電壓±0.1 kV或調(diào)整電容以延長(zhǎng)時(shí)間常數(shù)。
杭州實(shí)了個(gè)驗(yàn)生物科技有限公司
