伯樂(Bio-Rad)Gene Pulser Xcell 電穿孔儀是一種高精度、高穩(wěn)定性的基因?qū)朐O(shè)備,通過短暫高壓脈沖使細(xì)胞膜產(chǎn)生可逆性微孔,從而實(shí)現(xiàn)DNA、RNA、蛋白質(zhì)等大分子的導(dǎo)入。該儀器被廣泛應(yīng)用于分子克隆、基因編輯、疫苗研發(fā)以及細(xì)胞功能研究等領(lǐng)域。
在正式開展實(shí)驗(yàn)之前,充分的準(zhǔn)備是確保實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備包括設(shè)備檢查、參數(shù)設(shè)定、試劑與樣品的處理、操作環(huán)境控制以及安全防護(hù)等內(nèi)容。規(guī)范、系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備不僅能減少實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn),還能提高轉(zhuǎn)化效率和重復(fù)性。
電穿孔實(shí)驗(yàn)屬于高能量瞬時(shí)放電操作,對(duì)操作環(huán)境、試劑純度及人員技能要求較高。整體準(zhǔn)備應(yīng)遵循以下原則:
確保安全:所有高壓設(shè)備應(yīng)接地良好,操作人員應(yīng)經(jīng)過培訓(xùn);
確保清潔:實(shí)驗(yàn)環(huán)境需無塵、無鹽霧、無雜質(zhì),以防電??;
確保精確:所有試劑與細(xì)胞樣品應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)化流程制備;
確保一致性:每一步操作需嚴(yán)格執(zhí)行既定時(shí)間與溫度條件。
在使用 Gene Pulser Xcell 電穿孔儀前,應(yīng)對(duì)設(shè)備進(jìn)行全面外觀檢查:
儀器外殼無裂痕、無灰塵、無液體滲入;
電源線及接地線完好;
前端電極插口無氧化或鹽分殘留;
電穿孔杯接口清潔、無導(dǎo)電液殘留;
顯示屏與按鍵響應(yīng)靈敏,無死機(jī)現(xiàn)象;
Pulse Controller 模塊連接牢固,無松動(dòng)。
任何異常必須在開機(jī)前排除,禁止帶故障運(yùn)行。
電穿孔儀需使用220V±10%的穩(wěn)壓電源供電。
確認(rèn)電源插座具備接地端,且接地電阻小于4Ω;
禁止使用延長(zhǎng)線或非原廠電纜;
建議安裝獨(dú)立穩(wěn)壓器或UPS電源,以防瞬時(shí)電壓波動(dòng)。
開機(jī)后系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)進(jìn)入自檢狀態(tài),檢測(cè)內(nèi)部電容、電阻模塊、傳感電路及溫度傳感器。
自檢成功后屏幕顯示“Ready”;
若出現(xiàn)“Error”提示,應(yīng)參閱儀器說明書或聯(lián)系廠家服務(wù)中心處理;
自檢通過后方可進(jìn)行參數(shù)設(shè)定。
電穿孔杯是實(shí)驗(yàn)中與樣品直接接觸的關(guān)鍵部件。其質(zhì)量與清潔度直接決定電場(chǎng)分布的均勻性。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象選擇不同間隙的杯體:
0.1 cm 間隙:適用于小體積細(xì)菌或小顆粒細(xì)胞;
0.2 cm 間隙:常用于大腸桿菌與酵母;
0.4 cm 間隙:用于動(dòng)物細(xì)胞與植物原生質(zhì)體。
使用前后需徹底清潔:
以無離子水沖洗3次,70%乙醇浸泡10分鐘后晾干;
不得使用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或金屬刷清洗,以免損壞電極;
干燥后置于無塵盒中保存,避免灰塵和水汽。
包括連接電纜、轉(zhuǎn)化管、移液槍、微量離心管等均需潔凈、無鹽分污染。
電穿孔實(shí)驗(yàn)要求細(xì)胞電阻低且細(xì)胞膜易受電場(chǎng)作用,因此需提前制備高質(zhì)量感受態(tài)細(xì)胞。
以大腸桿菌為例:
從單克隆菌落接種入5 mL LB液體培養(yǎng)基,37℃、200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜;
次日1:100比例接種至新鮮LB培養(yǎng)基中;
當(dāng)OD600≈0.5時(shí)迅速放入冰上冷卻;
4℃、4000 rpm離心10 min,棄上清;
用預(yù)冷10%甘油溶液洗滌3次;
最終重懸于適量甘油溶液中,濃度約2×10? cells/mL;
分裝于無菌管中備用,可低溫保存。
若為真核細(xì)胞(如CHO、HEK293),需提前24小時(shí)培養(yǎng)至70–80%融合度,并使用胰酶消化后洗滌兩次,懸浮于無Ca2?、無Mg2? PBS中。
電穿孔對(duì)樣品純度要求極高,質(zhì)粒必須完全脫鹽。
使用高純度提取試劑盒或柱式純化法獲得DNA;
測(cè)定濃度保持在50–100 ng/μL;
避免使用含Tris或EDTA的緩沖液,可改用無離子水溶解;
質(zhì)粒溶液應(yīng)澄清透明,無沉淀。
用于電擊后細(xì)胞修復(fù)的培養(yǎng)基建議使用SOC或特制復(fù)蘇液,確保pH 7.0–7.2。
SOC組成:胰蛋白胨2%、酵母提取物0.5%、NaCl 10 mM、KCl 2.5 mM、MgCl? 10 mM、葡萄糖20 mM;
使用前預(yù)熱至37℃。
實(shí)驗(yàn)區(qū)應(yīng)分為“準(zhǔn)備區(qū)”“電擊區(qū)”和“培養(yǎng)區(qū)”:
準(zhǔn)備區(qū):用于試劑混合與細(xì)胞處理,應(yīng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)操作;
電擊區(qū):安放電穿孔儀及冰浴裝置,遠(yuǎn)離易燃材料;
培養(yǎng)區(qū):用于電擊后復(fù)蘇及平板培養(yǎng),保持恒溫。
電擊操作建議在4℃條件下進(jìn)行,可減少細(xì)胞死亡率;
電擊前電穿孔杯應(yīng)預(yù)冷至少10分鐘;
復(fù)蘇培養(yǎng)需維持37℃恒溫。
實(shí)驗(yàn)室相對(duì)濕度應(yīng)控制在40–60%;
使用防靜電臺(tái)墊,操作人員佩戴接地手環(huán),以避免高壓放電偏移。
人員要求:操作人員需熟悉電穿孔原理、儀器結(jié)構(gòu)及安全規(guī)范;
防護(hù)措施:穿防靜電實(shí)驗(yàn)服,佩戴絕緣手套、護(hù)目鏡;
安全意識(shí):在高壓電源接通前嚴(yán)禁接觸電極;
記錄習(xí)慣:實(shí)驗(yàn)前應(yīng)準(zhǔn)備好記錄表格,包括參數(shù)、樣品批次、時(shí)間及溫度。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)設(shè)定以下參數(shù):
電壓(Voltage):決定電場(chǎng)強(qiáng)度;
電容(Capacitance):決定脈沖持續(xù)時(shí)間;
電阻(Resistance):控制能量釋放速度;
時(shí)間常數(shù)(Time Constant):反映放電特性。
常用設(shè)定舉例(大腸桿菌):
間隙:0.2 cm;
電壓:2.5 kV;
電容:25 μF;
電阻:200 Ω;
時(shí)間常數(shù):約4.5 ms。
連接空電穿孔杯,設(shè)定電壓200 V進(jìn)行試放電;
檢查波形是否平穩(wěn),是否出現(xiàn)電弧聲;
確認(rèn)顯示的時(shí)間常數(shù)與理論值一致;
若異常,立即停止并檢查連接。
樣品混合
取40 μL 感受態(tài)細(xì)胞加入到預(yù)冷電穿孔杯中;
加入1–2 μL質(zhì)粒DNA混勻;
保持液面平整,避免氣泡。
電擊前準(zhǔn)備
確認(rèn)儀器處于“Ready”狀態(tài);
設(shè)置參數(shù)并記錄;
電穿孔杯放置于儀器電極槽中并蓋上安全蓋。
電擊與復(fù)蘇
啟動(dòng)放電,放電時(shí)間約為4–5 ms;
放電結(jié)束后立即加入1 mL預(yù)溫SOC;
將樣品移至無菌管中,在37℃搖床上復(fù)蘇1小時(shí)。
后續(xù)培養(yǎng)準(zhǔn)備
涂布至含抗生素的LB平板;
37℃培養(yǎng)過夜;
次日統(tǒng)計(jì)菌落并計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。
所有操作須在低溫條件下進(jìn)行,防止細(xì)胞受熱;
質(zhì)粒與細(xì)胞混合后應(yīng)立即電擊,避免長(zhǎng)時(shí)間停留;
禁止使用含鹽緩沖液,以防電弧放電;
電擊后立即補(bǔ)加復(fù)蘇液;
每次使用后清洗電穿孔杯,確保下次使用安全;
若發(fā)現(xiàn)儀器異常聲響或顯示錯(cuò)誤,應(yīng)立刻斷電檢查。
電穿孔實(shí)驗(yàn)屬于高壓操作,必須遵守以下安全準(zhǔn)則:
實(shí)驗(yàn)區(qū)禁止存放易燃溶劑;
操作臺(tái)保持干燥;
不得拆卸電源模塊;
儀器維護(hù)由廠家專業(yè)人員完成;
操作過程中雙手遠(yuǎn)離電極區(qū)域。
在每次實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段,應(yīng)填寫《設(shè)備使用與準(zhǔn)備記錄表》,內(nèi)容包括:
日期與操作者;
設(shè)備編號(hào)與狀態(tài);
設(shè)定參數(shù);
樣品類型與批次;
試劑批號(hào)與保存條件;
備注與異常記錄。
記錄表應(yīng)歸檔保存,以便數(shù)據(jù)追溯與質(zhì)量管理審查。
長(zhǎng)沙實(shí)了個(gè)驗(yàn)儀器制造有限公司 為伯樂 Gene Pulser Xcell 系列儀器的技術(shù)支持與售后保障單位,提供以下服務(wù):
全程技術(shù)培訓(xùn)與遠(yuǎn)程指導(dǎo);
質(zhì)保3年只換不修,確保使用無憂;
定期系統(tǒng)校正與維護(hù);
軟件升級(jí)與參數(shù)優(yōu)化支持;
備件更換與原廠耗材供應(yīng)。
通過廠家專業(yè)保障,實(shí)驗(yàn)室可長(zhǎng)期保持儀器性能穩(wěn)定,避免因設(shè)備誤差影響科研數(shù)據(jù)。
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備是電穿孔成功的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。通過科學(xué)的設(shè)備檢查、合理的樣品處理、精確的參數(shù)設(shè)定與嚴(yán)格的安全管理,可以顯著提升實(shí)驗(yàn)成功率與數(shù)據(jù)穩(wěn)定性。
在整個(gè)準(zhǔn)備階段,應(yīng)做到:
儀器性能完好、參數(shù)校準(zhǔn)精確;
樣品純度高、無鹽污染;
實(shí)驗(yàn)環(huán)境潔凈、安全;
操作規(guī)范、記錄完整。
伯樂 Gene Pulser Xcell 電穿孔儀以其精準(zhǔn)控制、可重復(fù)性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì),已成為各類轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的首選設(shè)備。在長(zhǎng)沙實(shí)了個(gè)驗(yàn)儀器制造有限公司的技術(shù)支持與三年質(zhì)保承諾下,用戶可放心進(jìn)行高水平的基因?qū)雽?shí)驗(yàn)。
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