伯樂Genepulser Xcell電穿孔儀樣品加載介紹

一、引言

伯樂（Bio-Rad）Genepulser Xcell電穿孔儀是現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的高性能電穿孔設(shè)備，主要用于將DNA、RNA、蛋白質(zhì)或其他外源分子導(dǎo)入各種類型的細(xì)胞中，如細(xì)菌、酵母、植物原生質(zhì)體以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞。電穿孔的成敗與電場參數(shù)設(shè)置密切相關(guān)，但同樣關(guān)鍵的是樣品的正確加載與處理。

合理的樣品加載不僅影響電穿孔效率和細(xì)胞存活率，還直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性和數(shù)據(jù)的可靠性。本篇將從準(zhǔn)備、裝載、運(yùn)行到后處理全過程，系統(tǒng)介紹Genepulser Xcell電穿孔儀的樣品加載方法與操作要點(diǎn)。

二、樣品加載的基本原理

電穿孔的核心機(jī)制是通過瞬間高壓電場在細(xì)胞膜上形成暫時(shí)性孔道，使外源分子進(jìn)入細(xì)胞。樣品加載的目標(biāo)是在保證電場均勻作用的前提下，使細(xì)胞和外源分子充分接觸，同時(shí)避免電弧放電或細(xì)胞損傷。

因此，樣品加載過程應(yīng)確保以下條件：

1. 電極間距離固定且液體體積合適；

2. 細(xì)胞濃度適宜且均勻分布；

3. 電導(dǎo)率和離子強(qiáng)度控制在安全范圍；

4. 樣品無氣泡、無顆粒雜質(zhì)；

5. 樣品溫度與設(shè)備參數(shù)相匹配。

只有在這些條件得到嚴(yán)格控制的情況下，電穿孔的能量才能均勻分布，細(xì)胞膜孔洞可逆恢復(fù)，達(dá)到高效轉(zhuǎn)化的目的。

三、樣品準(zhǔn)備階段

1. 細(xì)胞制備

不同細(xì)胞類型對(duì)電穿孔條件的敏感程度不同，但樣品制備的總體原則是一致的，即保持細(xì)胞活性、降低導(dǎo)電雜質(zhì)、避免鹽離子積累。

• 細(xì)菌細(xì)胞（如大腸桿菌）：
  通常使用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行處理，收集后用無離子水或低離子緩沖液（如10%甘油）反復(fù)洗滌，以去除培養(yǎng)基中的鹽分。離心后重懸，最終細(xì)胞濃度控制在1×10?個(gè)/mL左右。

• 真核細(xì)胞（如哺乳動(dòng)物細(xì)胞）：
  應(yīng)保持細(xì)胞狀態(tài)良好，無明顯凋亡或壞死。常用PBS洗滌去除培養(yǎng)液成分，再重懸于專用電穿孔緩沖液中。緩沖液應(yīng)低導(dǎo)電、pH穩(wěn)定，以防電擊時(shí)產(chǎn)生氣泡或電弧。

• 酵母或植物原生質(zhì)體：
  需在預(yù)處理后去除細(xì)胞壁，再進(jìn)行低離子緩沖液洗滌。特別注意防止?jié)B透壓變化引起的細(xì)胞破裂。

2. DNA或RNA樣品準(zhǔn)備

外源分子應(yīng)高度純化，無蛋白質(zhì)、鹽、乙醇等雜質(zhì)殘留。常使用純化柱法或乙醇沉淀法凈化質(zhì)粒DNA，溶解于低離子緩沖液（如TE或ddH?O）中。

DNA濃度一般控制在10–100 μg/mL范圍內(nèi)，過高可能增加導(dǎo)電性導(dǎo)致電弧放電，過低則降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 電穿孔緩沖液

電穿孔緩沖液在電穿孔體系中起到導(dǎo)電介質(zhì)的作用，既要保證電場傳導(dǎo)，又要防止細(xì)胞損傷。

常見緩沖體系包括：

• 10%甘油；

• 0.1 M蔗糖溶液；

• 專用低導(dǎo)電電穿孔緩沖液（如伯樂推薦緩沖液）。

電導(dǎo)率通?？刂圃?–8 mS/cm，pH值維持在7.0–7.5范圍內(nèi)。

四、樣品裝載準(zhǔn)備

1. 電穿孔杯（Cuvette）的選擇與清潔

Genepulser Xcell配套使用標(biāo)準(zhǔn)電穿孔杯，常見間距為0.1 cm、0.2 cm和0.4 cm三種規(guī)格。間距越小，所需電壓越低，適合細(xì)胞較脆弱的類型；間距較大則適合細(xì)菌等耐受性強(qiáng)的細(xì)胞。

在樣品加載前，應(yīng)確保電穿孔杯：

• 完全干凈，無殘留鹽或樣品；

• 電極無腐蝕或氧化；

• 使用前用無離子水沖洗并70%乙醇消毒；

• 充分風(fēng)干后再裝樣，以防液體短路。

2. 樣品混合比例

電穿孔體系通常由以下三部分組成：

• 細(xì)胞懸液；

• 外源DNA/RNA；

• 電穿孔緩沖液。

混合比例一般為：

• 細(xì)胞：DNA體積比為100:1；

• 最終體系體積為0.4–0.8 mL（根據(jù)電極間距確定）。

混合時(shí)應(yīng)輕輕吸打或使用低速渦旋混勻，避免產(chǎn)生氣泡。

3. 氣泡檢查與樣品轉(zhuǎn)移

氣泡是電穿孔失敗的主要原因之一。氣泡存在會(huì)造成電流集中，形成電弧放電，導(dǎo)致樣品燒毀或細(xì)胞死亡。
裝載樣品時(shí)應(yīng)：

• 使用細(xì)嘴移液器緩慢注入；

• 保持電極片平行方向裝樣；

• 注樣完畢后輕輕敲擊電穿孔杯底部，使氣泡上浮消除；

• 觀察液面是否覆蓋電極，保證導(dǎo)電路徑完整。

五、樣品加載操作步驟

1. 準(zhǔn)備儀器
   打開Genepulser Xcell主機(jī)電源，確保顯示屏處于“Ready”狀態(tài)。檢查模塊連接是否正確，包括電容模塊、電阻模塊和電極接口。

2. 放置電穿孔杯
   打開電極架，將裝好樣品的電穿孔杯放入插槽，確保方向正確，杯體與電極完全接觸。

3. 確認(rèn)參數(shù)設(shè)置
   根據(jù)實(shí)驗(yàn)類型選擇適當(dāng)模式（如指數(shù)衰減波或方波），輸入電壓、電容、電阻及脈沖時(shí)間參數(shù)。
   例如：

• 大腸桿菌：2.5 kV，25 μF，200 Ω；

• 酵母：1.5 kV，50 μF；

• 哺乳動(dòng)物細(xì)胞：250–400 V，方波模式。

4. 執(zhí)行電穿孔
   按下“Pulse”鍵后，系統(tǒng)自動(dòng)完成能量釋放。屏幕實(shí)時(shí)顯示電壓與電流變化曲線。操作員應(yīng)在設(shè)備提示“Complete”前勿移動(dòng)電極或取出樣品。

5. 樣品取出
   操作完成后，立即取出電穿孔杯，用無菌移液器吸出樣品至離心管中。此時(shí)細(xì)胞處于高應(yīng)激狀態(tài)，應(yīng)盡快加入復(fù)蘇液或培養(yǎng)基進(jìn)行恢復(fù)。

六、電穿孔后樣品處理

1. 復(fù)蘇階段

電穿孔后的細(xì)胞膜處于暫時(shí)性開放狀態(tài)，需在無選擇壓力條件下復(fù)蘇以修復(fù)膜結(jié)構(gòu)。

常用復(fù)蘇方案如下：

• 加入預(yù)溫的LB或DMEM培養(yǎng)基；

• 靜置冰上5分鐘，然后在37°C或適宜溫度下培養(yǎng)45分鐘；

• 對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可在培養(yǎng)皿中靜置1–2小時(shí)后換液。

復(fù)蘇期過短可能導(dǎo)致細(xì)胞未恢復(fù)即暴露于選擇壓力中，從而影響轉(zhuǎn)化率。

2. 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物處理

細(xì)菌樣品可直接涂布含抗性篩選的平板；真核細(xì)胞則可進(jìn)行培養(yǎng)傳代或進(jìn)一步檢測基因表達(dá)。
在此過程中，建議保存一部分未經(jīng)電穿孔的對(duì)照樣品，用于比較細(xì)胞存活率和導(dǎo)入效率。

3. 樣品殘留與設(shè)備清理

電穿孔完成后，應(yīng)立即清洗電穿孔杯。若杯體重復(fù)使用，應(yīng)：

• 先用去離子水沖洗；

• 再用70%乙醇浸泡5分鐘；

• 風(fēng)干儲(chǔ)存于無塵環(huán)境。

電極架可用無水乙醇擦拭，保持干燥，防止腐蝕。主機(jī)外殼使用干凈布巾擦拭，避免液體進(jìn)入接口。

七、常見問題與排查

1. 出現(xiàn)電弧放電（Arcing）

• 原因：樣品中離子濃度過高、存在氣泡、電極未干凈；

• 解決：增加洗滌次數(shù)、檢查電極杯清潔度、重新裝樣。

2. 電壓過低或電流異常

• 原因：連接不良、電極腐蝕或液體接觸不充分；

• 解決：重新插緊接口、更換電極杯。

3. 細(xì)胞存活率低

• 原因：電壓過高、復(fù)蘇不充分；

• 解決：優(yōu)化參數(shù)、延長恢復(fù)時(shí)間或降低電壓。

4. 轉(zhuǎn)化效率低

• 原因：DNA純度不足、脈沖時(shí)間不合適；

• 解決：使用高純度DNA、調(diào)整脈沖寬度或電場強(qiáng)度。

八、安全注意事項(xiàng)

• 電穿孔儀屬于高壓設(shè)備，操作時(shí)嚴(yán)禁用手觸碰電極；

• 樣品裝載與取出過程中應(yīng)關(guān)閉電源；

• 若發(fā)生電弧或異響，應(yīng)立即停止實(shí)驗(yàn)；

• 不得使用破裂或老化的電穿孔杯；

• 操作區(qū)域應(yīng)保持干燥，防止導(dǎo)電液體外泄；

• 建議佩戴絕緣手套和防護(hù)眼鏡；

• 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后關(guān)閉主機(jī)電源并拔除插頭。

九、操作規(guī)范與優(yōu)化建議

1. 每次實(shí)驗(yàn)前應(yīng)先進(jìn)行空載測試，確認(rèn)設(shè)備運(yùn)行正常；

2. 同一實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)三次以上，驗(yàn)證穩(wěn)定性；

3. 使用預(yù)冷的樣品可減少熱損傷；

4. 對(duì)難轉(zhuǎn)染細(xì)胞可嘗試雙脈沖模式或降低電阻值；

5. 樣品量不宜超過電穿孔杯標(biāo)注最大容量；

6. 若需處理多個(gè)樣品，應(yīng)嚴(yán)格區(qū)分電極間距與參數(shù)，避免混淆；

7. 建議在電穿孔后立即記錄實(shí)驗(yàn)條件，以便優(yōu)化。

十、總結(jié)

伯樂Genepulser Xcell電穿孔儀的樣品加載過程是電穿孔成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。它不僅涉及細(xì)胞與DNA的物理混合，更體現(xiàn)了對(duì)電化學(xué)參數(shù)與實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)的精準(zhǔn)控制。通過規(guī)范的樣品準(zhǔn)備、嚴(yán)格的加載步驟與周密的安全措施，研究人員可以有效提高轉(zhuǎn)化率、減少實(shí)驗(yàn)誤差并延長設(shè)備壽命。

科學(xué)合理的樣品加載能夠確保電場能量均勻作用，避免電弧與細(xì)胞損傷，從而實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的分子導(dǎo)入效果。掌握Genepulser Xcell的樣品加載技術(shù)，對(duì)于任何從事分子克隆、基因編輯或細(xì)胞工程的實(shí)驗(yàn)人員而言，都是實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量科研結(jié)果的重要基礎(chǔ)。